在细胞生物学研究、临床细胞治疗及生物制品生产中，细胞的长期稳定保存是核心环节之一。细胞冻存技术通过降低细胞代谢速率，实现细胞活性的长期维持，而细胞冻存液作为该技术的关键试剂，其成分组成与性能直接决定了细胞冻存后的存活率、生物学特性稳定性及后续应用安全性。本文将基于细胞冻存液的核心特性，从分类、选择原则及应用注意事项三方面进行详细说明，为相关领域的实践提供参考。

一、细胞冻存液的分类

细胞冻存液的分类维度主要基于成分组成与操作流程，不同分类下的冻存液在保护机制、适用场景及操作要求上存在显著差异。

（一）按成分组成划分

成分是决定冻存液保护效果与安全性的核心因素，按成分可进一步细分为三类：基于保护剂渗透性、是否含血清、是否含 DMSO。

1. 按保护剂的渗透性划分：渗透性保护剂与非渗透性保护剂

细胞冻存过程中，低温易导致细胞内外形成冰晶、电解质浓度升高（溶质损伤）及细胞脱水皱缩，保护剂的核心作用是针对性缓解这些损伤。根据能否渗透进入细胞，保护剂可分为两类：

• 渗透性保护剂：
  这类保护剂的核心特征是分子量小、脂溶性强，可在细胞冷冻凝固前快速渗透进入细胞内部，其保护机制主要包括两点：① 降低细胞内外溶液的电解质浓度，避免高浓度电解质对细胞结构（如细胞膜、细胞器）的破坏；② 减少细胞内水分外渗，防止细胞因过度脱水而皱缩，同时抑制细胞内外冰晶的形成（冰晶会物理性刺破细胞膜）。
  常见的渗透性保护剂包括甘油、二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇、乙烯醇及乙酰胺等。其中，DMSO是目前应用最广泛的类型 —— 相较于甘油（渗透速度慢）、乙二醇（毒性较高），DMSO 的渗透效率更高、保护效果更稳定，因此成为常规冻存液的核心成分。

• 非渗透性保护剂：
  这类保护剂多为大分子物质（如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、葡聚糖、白蛋白、羟乙基淀粉（HES）），无法渗透进入细胞，其保护机制主要依赖 “间接作用”：① 优先与细胞外溶液中的水分子结合，减少 “自由水” 含量，降低溶液冰点，从而减少细胞外冰晶的形成；② 通过稀释效应降低细胞外溶液的电解质浓度，间接减轻溶质对细胞的损伤；③ 部分大分子（如白蛋白）可在细胞膜表面形成 “保护膜”，减少机械损伤。
  非渗透性保护剂常与渗透性保护剂配合使用（如血清中的白蛋白 + DMSO），形成 “内外协同” 的保护体系，进一步提升冻存效果。

• 
  

2. 按是否含血清划分：含血清冻存液与无血清冻存液

血清是传统细胞培养中的重要营养成分，但其动物源性特征限制了部分场景的应用，据此冻存液可分为两类：

• 含血清冻存液：
  传统冻存液多为 “基础培养基 + 胎牛血清 + DMSO” 的混合体系（常规比例为培养基：血清：DMSO=8:1:1，或培养基：血清 = 9:1 基础上添加 10% DMSO），血清的作用是模拟细胞天然生长环境，通过其中的蛋白、细胞因子等成分增强细胞对低温的耐受性。
  但其局限性也十分明显：① 动物源污染风险：血清来源于胎牛，可能携带病毒、霉菌、支原体等微生物，存在交叉污染隐患；② 批间稳定性差：不同批次血清的成分（如蛋白含量、细胞因子种类）存在差异，导致冻存效果不稳定；③ 临床应用受限：在细胞治疗（如 CAR-T 细胞治疗）中，动物源性成分可能引发人体免疫排斥反应，且难以满足 “可预知、可控制” 的生产要求，因此逐渐被无血清冻存液替代。
  此外，含血清冻存液需采用程序降温（4℃→-20℃→-80℃→液氮），原因是血清中大量蛋白在快速降温时易发生沉淀，沉淀会附着在细胞膜表面，导致细胞损伤。

• 无血清冻存液：
  这类冻存液以 “不含血清及动物源性蛋白” 为核心特征，通过人工合成的营养成分（如重组蛋白、化学定义的小分子）替代血清的功能，其优势包括：① 消除动物源污染风险，满足细胞治疗的临床安全标准；② 成分明确、批间差异小，冻存效果稳定；③ 无需依赖血清的营养补充，部分产品可适配更广泛的细胞类型（如干细胞、免疫细胞）。
  

3. 按是否含 DMSO 划分：含 DMSO 冻存液与无 DMSO 冻存液

DMSO 虽为高效渗透性保护剂，但其常温毒性限制了部分场景的应用，据此可分为两类：

• 含 DMSO 冻存液：
  这类冻存液是目前实验室最常规的类型（如 10% DMSO+90% 含血清培养基），DMSO 的核心优势是 “快速起效”—— 可在降温过程中迅速渗透进入细胞，为非程序降温提供基础（部分改良型含 DMSO 冻存液可简化降温步骤）。
  但其局限性不可忽视：常温下对细胞有毒性。研究数据显示，当培养液中 DMSO 浓度为 10% 时，细胞生长抑制率接近 100%；浓度降至 1% 时，抑制率仍达 35%；即使是 0.04% 的低浓度，也会对细胞增殖、分化等功能产生不利影响。因此，细胞复苏后必须通过离心彻底去除 DMSO，否则会影响后续细胞活性。
  在临床研究中，含 DMSO 冻存液还需额外评估两点：① DMSO 的毒副作用是否改变细胞的治疗功能（如免疫细胞的杀伤活性）；② 最终产品中 DMSO 的残留量是否符合临床安全标准（残留过高可能引发患者恶心、呕吐等不良反应）。

• 无 DMSO 冻存液：
  为解决 DMSO 的毒性问题，无 DMSO 冻存液的研发成为热点，其核心方向是寻找 DMSO 的替代保护剂，主要分为 “渗透性替代物” 和 “非渗透性替代物” 两类。目前，渗透性小分子化合物被认为是更具前景的方向（如某些糖醇类、酰胺类物质），其渗透效率接近 DMSO，且常温毒性更低。
  

（二）按操作过程划分：需程序降温冻存液与无需程序降温冻存液

细胞冻存的降温速率是影响细胞活性的关键参数 —— 降温过快易形成冰晶，过慢易导致细胞脱水，因此操作流程的核心差异在于 “是否需要程序降温”。

• 需程序降温冻存液：
  常规含血清 + DMSO 的冻存液多属于此类，其操作流程需严格遵循 “梯度降温” 步骤：① 将装有细胞的冻存管置于 4℃冰箱 10 分钟（初步降温，让细胞适应低温）；② 转移至 - 20℃冰箱 30 分钟（缓慢降温，减少冰晶形成）；③ 转移至 - 80℃冰箱 16-18 小时（深度降温，使细胞代谢接近停滞）；④ 最终转移至液氮罐（-196℃）长期储存。
  程序降温的核心目的是匹配含血清冻存液的成分特性 —— 避免血清中的蛋白沉淀及 DMSO 渗透不均导致的细胞损伤，但操作步骤繁琐、耗时较长，且需专人照看以避免降温步骤遗漏。

• 无需程序降温冻存液：
  这类冻存液以 “一步深冻” 为核心优势，主要包括改良型无血清冻存液、无 DMSO 冻存液，其成分设计（如高效保护剂组合、抗沉淀配方）可耐受快速降温，操作流程简化为 “细胞与冻存液混合后直接放入 - 80℃冰箱或液氮”，无需梯度降温步骤。
  其核心优势是节省时间、降低操作误差—— 无需专人照看，避免因程序降温步骤失误（如 - 20℃停留时间过长）导致的细胞死亡，尤其适用于大规模细胞冻存（如临床细胞治疗中的批量细胞制备）。

二、细胞冻存液的选择原则

选择冻存液时需综合考虑细胞类型、应用场景（研究 / 临床）、操作成本等因素，核心遵循以下五大原则，以实现 “高存活率、低损伤、高安全性” 的目标：

1. 最小化冻存与复苏损伤，保证高细胞存活率

这是选择冻存液的首要原则—— 冻存的核心目的是保留细胞活性，若存活率过低（如低于 50%），则后续实验或治疗无法开展。需根据细胞类型选择适配的保护体系：例如，对 DMSO 敏感的神经细胞应优先选择无 DMSO 冻存液；悬浮细胞（如免疫细胞）可选择无血清冻存液以避免血清中的黏附因子影响细胞形态；干细胞（如间充质干细胞）需选择能维持其分化潜能的冻存液，避免因保护剂毒性导致干细胞分化能力丢失。

2. 维持冻存细胞的生物学特性稳定

细胞复苏后的 “功能完整性” 与存活率同等重要 —— 即使存活率高，若细胞的形态、基因型、功能（如分泌因子能力、杀伤活性）发生改变，也会导致实验结果偏差或治疗失效。例如，临床 CAR-T 细胞冻存中，冻存液需保证 T 细胞的 CD3/CD8 阳性率、细胞因子（如 IL-2、IFN-γ）分泌能力不降低；干细胞冻存需保证其多向分化潜能（如成骨、成脂分化能力）无明显变化。因此，选择时需参考厂家提供的 “细胞特性验证数据”，或通过预实验（如复苏后检测细胞表面标志物、功能指标）确认稳定性。

3. 保护剂易去除，成分明确且无毒副作用

保护剂的 “后续影响” 是易被忽视的关键因素：① 若保护剂难以去除（如某些大分子替代物），残留会持续影响细胞活性；② 成分不明确（如含未知杂质的血清）可能引入干扰因素；③ 毒性过高（如部分 DMSO 替代物）会导致复苏后细胞功能异常。
对于临床应用场景，需额外满足 “对人体无毒”—— 例如，无血清、无 DMSO 冻存液需通过 “细胞毒性检测”“内毒素检测” 等合规性验证；对于实验室研究，需保证保护剂残留不影响后续实验（如流式检测、蛋白表达分析），例如 DMSO 需通过离心（1000-1500rpm，5 分钟）彻底去除，避免其影响细胞染色或荧光信号。

4. 快速起效，简化操作步骤

操作效率是大规模应用的重要考量：① 无需程序降温的冻存液可节省数小时的操作时间，减少人力成本；② 快速起效的保护剂（如 DMSO）可缩短细胞在低温下的暴露时间，降低损伤风险。例如，临床细胞治疗中，批量制备的 CAR-T 细胞需在短时间内完成冻存，无需程序降温的冻存液可显著提升制备效率；实验室高通量筛选实验中，简化的操作步骤可减少人为误差，保证实验重复性。

5. 平衡性能与成本

冻存液的价格差异较大（如无血清无 DMSO 冻存液价格约为传统含血清冻存液的 5-10 倍），选择时需结合应用场景平衡 “性能需求” 与 “成本预算”：① 实验室常规研究（如细胞系传代保存）可选择性价比高的含血清冻存液（自行配制，成本低）；② 临床研究或敏感细胞（如原代细胞、干细胞）冻存需优先选择性能稳定的无血清 / 无 DMSO 冻存液，即使成本较高，也可避免因冻存失败导致的更大损失（如临床样本浪费、实验周期延长）。

三、细胞冻存液的应用注意事项

即使选择了适配的冻存液，操作不当仍可能导致细胞损伤，需重点关注以下三点：

1. 常规含 DMSO 冻存液的配制与使用禁忌

常规冻存液（基础培养基 + 10% 血清 + 10% DMSO）的配制存在 “放热风险”——DMSO 溶于培养基时会释放大量热量，若直接将 DMSO 加入含细胞的培养液中，高温会 “烫伤” 细胞，导致细胞膜破裂、细胞死亡。
正确操作方式：① 提前配制：在无细胞的环境下，将 DMSO 缓慢加入基础培养基（或培养基 + 血清混合液）中，边加边轻轻混匀，室温放置 1-2 小时平衡温度，待热量完全释放后再使用；② 避免直接混合：严禁将 DMSO 直接滴加至细胞悬液中，需先将配制好的冻存液与细胞悬液按比例混合（如 1:1 或 2:1，根据细胞浓度调整），确保细胞均匀接触冻存液。

2. 无 DMSO 冻存液的替代成分安全性验证

选择无 DMSO 冻存液时，需避免 “为无 DMSO 而无 DMSO” 的误区 —— 部分 DMSO 替代物（如某些高浓度糖醇类物质）的毒性可能高于 DMSO，若盲目使用，反而会导致细胞存活率降低。
关键验证步骤：① 确认替代成分的物质基础：通过厂家说明书或文献查询替代物的化学名称、毒性数据（如半数致死浓度 LC50），优先选择已发表过应用案例的成分；② 预实验验证：用少量细胞进行冻存 - 复苏预实验，对比该冻存液与常规含 DMSO 冻存液的存活率、细胞功能，确认替代成分无明显负面影响。

3. 无血清 / 无 DMSO 冻存液的污染与支原体检测

无血清冻存液虽消除了血清的动物源污染风险，但仍可能因生产过程（如原料污染、分装环境）引入微生物污染，其中支原体污染是最隐蔽的问题 —— 支原体无细胞壁，无法被常规抗生素抑制，且会附着在细胞表面，掠夺营养并分泌毒性物质，导致细胞生长缓慢、功能异常（如干细胞分化能力下降、免疫细胞杀伤活性降低）。
必做检测：① 细菌 / 真菌污染检测：冻存前观察冻存液是否浑浊、有沉淀，或通过无菌培养（如接种至 LB 培养基）确认无微生物生长；② 支原体检测：采用标准方法（如 PCR 法、荧光染色法）检测冻存液或复苏后的细胞，确保支原体阴性 —— 尤其是临床级冻存液，需符合《中华人民共和国药典》中 “生物制品支原体检查法” 的要求。

结语

细胞冻存液的选择与应用是细胞长期保存的核心环节，其分类维度（成分、操作）决定了适用场景，选择原则需围绕 “存活率、稳定性、安全性、效率、成本” 综合考量，而操作注意事项则是避免人为损伤的关键。随着细胞治疗、再生医学等领域的发展，无血清、无 DMSO、无动物源成分、免程序降温的 “三无一免” 冻存液将成为未来的主流方向，但其性能验证与合规性仍需进一步完善，以满足更高标准的应用需求。