几十年来，传统的治疗方式，如化疗、放疗和手术，一直是治疗各种癌症类型的基础。这些干预措施对不断分裂的细胞具有普遍且高度攻击性的效果。尽管这些方式显示出了疗效，但仍存在重大挑战，包括疾病复发和内在药物抗性的增加，更不用说潜在的副作用；因此，迫切需要探索能够为肿瘤学领域提供安全有效解决方案的创新替代方案。这一重要问题促使肿瘤学和免疫学的融合，为免疫肿瘤学领域的出现铺平了道路。这一学科的当代进步揭示了基于增强机体固有免疫反应的抗肿瘤治疗新方法。这些新兴策略不仅有可能提高患者的生活质量，还能扩大他们的生存前景。鉴于淋巴细胞对肿瘤进展动态的重大影响，创新的治疗策略使它们更加突出。这些策略追求通过基因操作重新激活和加强淋巴细胞的抗肿瘤能力，产生了众所周知的嵌合抗原受体T细胞（CAR T细胞）。这些细胞经过基因修改，表达能够识别恶性细胞的合成嵌合受体，目的是触发一个旨在彻底根除肿瘤的过程。

半个多世纪前，Avrion Mitchison通过在小鼠模型上的肿瘤移植实验研究提出了抗肿瘤细胞治疗的概念。这些研究表明，通过移植淋巴结，它们的体积增加，并表现出强化的免疫反应。在过去的二十年中，T细胞免疫疗法从被认为是边缘兴趣转变为被认为是潜在的替代疗法。从Gross等人对细胞毒性T淋巴细胞向肿瘤细胞的基因重定向的开创性研究开始，这种方法在抗癌斗争中的前景越来越受到关注，这导致了第一代CAR的发展。自这种初步设计以来，这些受体的配置已经发展到第四代。然而，仍然有机会改进和优化这些组件，开启了更有效和更安全肿瘤治疗的新时代。

在当代背景下，CAR T细胞疗法经历了显著的进展。使用这些生物医学技术的临床试验已经在美国和中国等国家获得监管批准，美国食品药品监督管理局（FDA）等机构批准了特定药物用于治疗急性淋巴细胞性白血病（ALL）和弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）等血液肿瘤和难治性癌症。这些成功的举措催化了后续研究的强劲扩张，并在这一科学领域产生了显著的热情。

然而，在实体肿瘤的情况下，CAR T细胞疗法的适用性受到相当大的限制。对广泛范围的肿瘤进行的众多研究表明，内在障碍限制了CAR T细胞在实体恶性肿瘤中的疗效。这些障碍包括识别能够选择性识别目标细胞的特定肿瘤抗原，固有的空间定位肿瘤区域的困难，以及与这些细胞在敌对肿瘤微环境中的渗透和存活相关的挑战。这些限制一直是针对实体肿瘤的几项临床试验中免疫调节疗法表现不足的因素。

在当前的研究状况下，一个突出的兴趣焦点在于开发可以减轻这些复杂挑战的创新策略。最终目标是实现CAR T细胞的适应，使它们能够在包括实体肿瘤在内的广泛恶性肿瘤中有效且安全地发挥作用。

本综述的目标是严格检查CAR T细胞疗法在实体肿瘤领域面临的特定挑战，并概述可以实施的新兴治疗策略，以增加这些治疗方式在临床疗效方面的比较，与它们对抗血液肿瘤的表现相比。

2.CAR T细胞：起源和结构 

CAR T细胞疗法代表了一种开创性的自体和多克隆治疗，由Rosenberg等人在1988年为管理晚期肿瘤而设计。在这种方法中，T淋巴细胞被基因修改以表达基于抗体结构的嵌合抗原受体（CAR）。在这方面，这些修改后的细胞比它们的传统对应物更擅长识别和根除肿瘤细胞（见图1）。

从分子角度来看，这些CAR的基本结构融合了T细胞受体和抗体等内在元素。具体来说，CAR由负责抗原结合的细胞外结构域和参与信号传导途径的细胞内结构域组成。由单链可变片段(scFV)组成的细胞外部分，使T细胞能够识别并结合特定的肿瘤抗原。随后的淋巴细胞激活是通过源自免疫受体CD3 ITAM的酪氨酸基激活基序的细胞内结构域实现的，从而提高了亲和力并避免了MHC的限制，实现了优化的肿瘤识别。

为了完成CAR的结构，跨膜结构域和通常来源于免疫球蛋白或CD8α的间隔区域，巩固了scFV与细胞内结构域之间的联系。

临床试验中CAR设计的演变分为几代。第一代CAR[22]结合了基于抗体的细胞外信号结构域和细胞内CD3（信号结构域。然而，这些受体缺乏共刺激元素，限制了它们的持久性和抗肿瘤效果。完整的细胞激活至少需要两种不同的信号：直接的TCR信号和通常由抗原呈递细胞（APCs）中的分子如CD28或CD86介导的共刺激途径。这种共刺激可以催化显著的细胞反应，包括淋巴细胞的激活和持久性。

共刺激的需求促进了第二代CAR的发展，这些CAR整合了CD28和4-1BB等分子。这些结构域增强了淋巴细胞的持久性和快速激活，对于强大的信号传导、淋巴细胞的增殖以及T细胞中的表观遗传和代谢变化至关重要。尽管取得了成就，第二代CAR在某些癌症中的效力和安全性面临挑战，这激发了第三代CAR的开发。这一代整合了多个信号传导和共刺激结构域，增强了效果。最后，第四代CAR，即TRUCKS，出现了，它包括两个单独的转基因，并与激活细胞因子（如IL-12）同时表达前几代的CAR。这一代CAR被引入以主动调节肿瘤微环境并增强CAR T细胞。

3.作用机制 

CAR T细胞的激活基于一系列分子和细胞相互作用，其特异性由嵌合受体的特定结构决定。尽管涉及的完整机制尚未全面描述，但FDA批准的药物的作用模式已经建立，如Yescarta和Kymriah。这些治疗程序从获取和后来重新编程患者自己的T细胞开始，这些细胞通过编码特定于CD19抗原的CAR的转基因进行基因修改，CD19抗原是B淋巴细胞细胞膜上表达的独特标记。

这些CAR的结构包括一个能够识别CD19的scFV片段，该片段与分化的细胞内结构域融合，无论是4-1BB（Kymriah的情况）还是CD28（Yescarta的情况），以及CD3ζ结构域。一旦CAR识别并结合到CD19+细胞，就会触发一系列信号事件，从ITAMs的磷酸化开始，最终激活、扩增和持久性改善的修饰淋巴细胞。此外，这些淋巴细胞获得效应功能，分泌促炎细胞因子和趋化因子，并释放对靶细胞产生直接溶解效应的细胞毒性颗粒。

肿瘤细胞的消除过程由两个主要途径协调。CD4+ T淋巴细胞主要释放含有穿孔素和颗粒酶的颗粒。同时，通过Fas/Fas配体信号通路（FasL）激活死亡受体被认为是另一种运作机制。此外，CD8+ T淋巴细胞表现出通过两种途径破坏肿瘤细胞的能力，这表明了免疫识别和消除系统的复杂性和冗余性（见图2）。在这种情况下，这些途径的动态和协调反映了免疫对肿瘤细胞反应的复杂性和多因素性（见图2）。

4.实体肿瘤中无效的原因 

在实体肿瘤的背景下，有许多生理和生化障碍使CAR T细胞疗法的效力变得复杂。与液体恶性肿瘤（见表1）不同，调节治疗效果的多因素元素是治疗的理想肿瘤抗原的缺乏，存在具有免疫抑制功能的肿瘤微环境，以及T淋巴细胞归巢到肿瘤部位的不足。这些障碍协同作用，增加了这些类型肿瘤的治疗景观的复杂性。必须考虑的是，这些因素并不孤立工作，而是在一个可能影响治疗效果的相互作用网络中相互关联。例如，缺乏足够的肿瘤抗原可能与肿瘤环境的适应性变化内在相关，这可能影响T淋巴细胞归巢的效力。在这方面，克服这些障碍不仅仅是单独解决每个因素的问题，而是理解和调节整个系统以优化免疫治疗反应。因此，识别和克服这些障碍不仅会催化更有效的免疫疗法的显著进展，而且可能代表癌症治疗整体策略的范式转变。

癌细胞表达一系列分子，通常是蛋白质性质的，称为抗原，能够触发免疫反应。免疫细胞，例如淋巴细胞，其表面有受体分子与这些抗原结合，从而允许启动一系列反应，最终导致目标的破坏；然而，由于其突变行为，恶性细胞经常变得能够逃避免疫系统，这导致更好的肿瘤扩散。因此，CAR T细胞受体具有专门的结构域，独立于MHC分子识别特定肿瘤抗原，因此允许它们破坏存在抗原分子的细胞。

因此，适当的抗原选择是一项关键任务，它在设计新的CAR时决定了成功与失败之间的区别。在这方面，液体肿瘤治疗中经常使用的抗原，如ALL和DLBCL，是CD19分子。它在绝大多数B淋巴细胞中表达，包括正常和转化的细胞。这一特性导致了高水平的有效性和通常令人满意的结果。然而，其缺乏特异性限制了其治疗潜力，因为它涉及严重且往往是致命的副作用。这一点在2010年一位接受CD19靶向CAR T细胞治疗的患者死亡后特别明显，尽管值得一提的是，死亡原因被认为是由预处理方案引起的潜在感染，而不是抗原本身（见图3）。

除了CD19，液体肿瘤中经常使用的其他抗原是CD22和CD30。前者在B淋巴细胞表面表达，其使用已被认为是治疗B-ALL的考虑，因为在CD19治疗过程中发生了多起抗原丢失的案例。另一方面，CD30是肿瘤坏死因子（TNF）家族的成员，由于其在Reed-Stemberg细胞中的存在，最近被用作CAR的可能靶标。新的治疗试验表明这些疗法可能有效，以及由于抗原特异性而减少副作用的可能性。

然而，在实体肿瘤的情况下，由于存在几个障碍，抗原选择已被证明是具有挑战性的。TCR对内在MHC肽段（如肿瘤抗原）的亲和力低于病原体衍生的肽段。因此，在大多数情况下，很难分离出在识别TAAs（肿瘤相关抗原）时比病原体衍生抗原更敏感的T细胞。

此外，在实体肿瘤的情况下，找到仅在转化细胞中表达的表面抗原更具挑战性，因为与液体肿瘤不同，这些主要由上皮细胞系组成，这些细胞系具有较少的表面抗原和增加的异质性。因此，抗原丢失或肿瘤逃逸是可能发生的情况。在这方面，尽管用于实体肿瘤的抗原已经从实验阶段跨越到临床试验，但迄今为止，它们未能显示出与液体肿瘤中使用的靶标相当的疗效。

这一点在对不同类型实体恶性肿瘤进行的多项临床试验中得到了证实。例如，在2010年进行的一个案例报告中，输注针对Her2/Neu抗原的CAR T细胞最终导致患者死亡，这是由于对正常肺和心脏组织的攻击。这一事件表明，正确的抗原选择对于这些疗法的安全性和成功至关重要。

另一个相关的案例是EGFR分子，它是一种酪氨酸激酶跨膜受体，被归类为组织抗原，表达在皮肤、消化道、肾脏和其他健康组织中。它在某些恶性肿瘤如肺癌、胰腺癌、乳腺癌和结直肠癌以及头颈鳞状细胞癌(HNSCC)中以异常数量产生。其存在与存活率降低有关，因为它在细胞增殖、分裂和转移中发挥作用。这个抗原在I期临床试验中被使用，在11名可评估的非小细胞肺癌(NSCLC)患者中，有2名患者表现出部分反应，5名患者的病情在2到8个月内保持稳定。此外，观察到CARs在组织和血液中的持久性，并在某些情况下伴有轻微的副作用，如恶心、呕吐、呼吸困难和低血压。

在卵巢癌和乳腺癌的情况下，跨膜糖蛋白HER2的过度表达与恶性转化以及癌症发生和存活率降低有关。它也可以在骨肉瘤、胶质母细胞瘤(GBM)和髓母细胞瘤中找到。目前，使用这个靶标的多项临床试验正在进行中，然而像拉帕替尼或曲妥珠单抗这样的药物通常产生了不利的结果。

CAIX抗原在肾癌中过度表达，在正常细胞中不存在，是另一个在I/II期临床试验中使用的目标。在对12名转移性肾细胞癌患者进行的研究中，在输注了10天剂量后，观察到治疗的负面反应。

这些副作用是由针对CARs的特定抗体形成以及存在的严重细胞毒性（2-4级）和肝浸润引起的，这些都阻碍了某些患者完成治疗。

或者，在胎儿发育或免疫特权部位表达的肿瘤抗原，例如CEA（癌胚抗原），存在于某些癌症中，如结直肠癌、胰腺腺癌和乳腺癌，并且已被考虑用于免疫疗法。然而，这些抗原通常位于细胞质内，因此对CARs来说是不可接近的。尽管如此，合成具有能够识别细胞质抗原的scFV结构域的CARs可以规避这个问题。

最后，表达在特定组织或细胞系中的抗原是最广泛使用的抗原种类。尽管不可或缺的器官也可能受到影响，但毒性控制是可行的，因此，使用这些抗原的治疗在大多数情况下不会导致致命结果。例如，在一项使用PSMA（前列腺特异性膜抗原）的临床试验中，PSMA是在恶性前列腺细胞上表达的抗原，观察到更大的抗肿瘤效力和有效的消除（见表2）。

肿瘤微环境代表一个复杂和异质的肿瘤内结构，包含了一系列肿瘤和非肿瘤细胞。在这个细胞系列中，成纤维细胞、脂肪细胞、周细胞、免疫细胞和基质细胞共存。除了这些细胞，肿瘤微环境还包括血管、细胞外基质和信号分子，在肿瘤发病机制中发挥着基本作用。

肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的动态相互作用对肿瘤细胞的恶性表型表达有决定性影响。这些相互作用促进了对肿瘤进展至关重要的特征的获得，表明肿瘤不仅仅是一个被动的旁观者，而是一个在促进癌症发生和晚期肿瘤发展中活跃且必不可少的因素。同样，肿瘤微环境的抑制性质对针对实体肿瘤的CAR T细胞的效力构成了重大挑战。

在这个复杂的矩阵中，迁移到肿瘤环境中的细胞面临许多障碍。这些包括具有免疫抑制特性的细胞和分子、CAR T细胞与肿瘤细胞之间相互作用导致的功能性抑制、肿瘤基质所呈现的物理障碍，以及一个以缺氧和有毒代谢物（如一氧化氮）水平升高为特征的生理上具有挑战性的环境。

4.2.1. 免疫检查点抑制剂

TME是一个复杂的动态系统，其中癌细胞和免疫组分不断共同进化。在这个复杂的格局中，肿瘤细胞有能力产生配体来抑制免疫检查点，以应对抗肿瘤T细胞（特别是细胞毒性T淋巴细胞CTL）的存在。这种适应性反应是TME复杂性和可塑性的体现。

在渗透TME后，T淋巴细胞开始分泌细胞因子，如干扰素-γ (IFN-γ)，这触发了PD-1、CEA CAM 1和CTLA-4等分子的表达。这一分子级联反应，因此，促进了免疫反应的逃避。这些抑制分子与T细胞上的检查点受体相互作用，如TIM3、LAG3、CD160和VISTA，通过几种机制导致细胞功能障碍。例如，LAG3对II类MHC分子进行负向调节，而TIM3在与特定免疫球蛋白如半乳糖凝集素-9结合后诱导凋亡并抑制T细胞。

从复杂性的角度来看，重要的是要考虑到，旨在对抗肿瘤的CAR T细胞与这个复杂的免疫抑制TME的相互作用方式尚未完全阐明。已经提出了CAR T细胞在进入TME后可能立即失去其细胞毒性和分泌功能的理论。这被称为“低功能性”状态。然而，我们仍然面临确定触发这些效应的特定因素的挑战。从整体和多学科的方法来理解这些机制是至关重要的，以揭示与TME相互作用的真正性质，并开发更有效的疗法。

4.2.2. 物理障碍

肿瘤基质的结构代表了一个复杂的物理障碍，可能会阻碍CAR T细胞的有效渗透。这个基质由细胞外基质（ECM）、血管和淋巴管、免疫细胞、间充质细胞和成纤维细胞组成，构成了一个密集的网状结构，为免疫系统的效应细胞提供了难以进入的途径。在某些情况下，这种结构的压实程度可能如此之大，以至于使肿瘤实际上对CAR T细胞的干预无动于衷，鉴于这些细胞的更大存在通常与更有利的预后相关，这是特别成问题的。

由于基质和癌细胞之间的生化和机械相互作用，这一场景的复杂性加剧了。这些相互作用引发了一系列代谢、遗传和形态变化，将细胞转化为有利于肿瘤进展和转移的病理形式。特定的基质组分，如ECM，富含调节元素，如蛋白多糖或糖肽，影响致癌过程中免疫反应的重塑。

在这种情况下，成纤维细胞经历了向癌症相关成纤维细胞（CAF）的表型转变。在这种改变的状态下，CAF表达效应分子，如成纤维细胞激活蛋白（FAP）和基质衍生因子1a（SDF1A）。这些分子与CAF协同作用，可以诱导ECM降解和胶原交叉桥接，从而促进肿瘤进展。据推测，CAFs中整合素的过度表达可能引发一系列促肿瘤事件，例如，强化致癌生长因子受体（GFR）信号传导，定植转移部位，以及促进邻近细胞外基质的肿瘤细胞存活。此外，基质的改变可以通过协调血管生成促进致癌和转移过程。

这一景象描绘了肿瘤基质生物学背后的细胞和分子相互作用的复杂网络，这为CAR T细胞疗法的优化增加了额外的复杂性。在这种情况下，更深入地了解肿瘤生态及其潜在机制对于开发更有效和更精确的疗法至关重要。

4.2.3. 代谢条件

TME是一个动态和复杂的系统，由肿瘤、基质和免疫细胞以及各种可溶性分子组成。其多面性以及组成部分之间的相互作用在肿瘤进展和对治疗的抵抗中发挥着基本作用，包括免疫疗法。

特别是，将肿瘤细胞与正常细胞区分开来的代谢条件是，即使在有氧条件下，它们也偏好通过有氧糖酵解来获取能量，这一现象被称为Warburg效应。必须认识到，不仅肿瘤细胞采用这种代谢机制。对于抗肿瘤免疫反应至关重要的效应T淋巴细胞也依赖于葡萄糖来促进它们的扩张。这种代谢巧合导致肿瘤区域的营养竞争，这些区域的营养不足。因此，代谢竞争可能会损害T细胞的功能和增殖，有利于肿瘤进展和转移。

糖酵解的副产品乳酸在TME中积累，这降低了局部pH水平。这种代谢性酸中毒并不是唯一对T细胞和细胞因子具有毒性的途径；来自其他代谢途径的代谢物，例如谷氨酰胺分解，也会产生免疫抑制作用，可能会损害CAR功能。

此外，TME的一个显著特征是其缺氧，这是由于血管生成不足和祖细胞不足以产生足够的血管。缺氧通过诱导糖酵解和支持肿瘤生长来促进肿瘤形成。尽管对免疫细胞的影响仍需深入探索，但已经确定缺氧可以使TAMs中的HIF-1α稳定，从而导致增加分泌促进肿瘤的分子和酶，这些分子和酶降解细胞外基质，从而促进肿瘤侵袭。

在TME中对氨基酸的竞争，特别是L-精氨酸和色氨酸，也对淋巴细胞的持久性和功能构成了重大挑战。这些氨基酸对许多细胞和代谢过程至关重要，它们的缺乏，由于恶性肿瘤细胞（如IDO和TDO）的酶过度表达而加剧，可能导致免疫功能障碍，损害T细胞识别和攻击肿瘤的能力。

4.3. 进入肿瘤区域

CAR T细胞在实体肿瘤中面临的一个难题是正确地迁移到肿瘤区域。与液体肿瘤不同，其中治疗目标很容易接近，因为它们要么在血液中循环，要么在淋巴中，要么在骨髓中找到，固体肿瘤位于组织中；因此，CAR T细胞必须被运送到这些特定部位。不幸的是，这种运输可能受到几个因素的影响。

一方面，CAR T细胞和液体肿瘤中的转化细胞具有共同的造血起源，这解释了为什么这些细胞倾向于迁移到相似的区域。另一方面，固体肿瘤有屏障，限制了CAR T细胞向其相应目标的迁移，而不管给药量。

尽管已经观察到CAR T细胞成功迁移到肿瘤基质并随后在该区域积累，但肿瘤实质仍然在很大程度上无法接近。无法渗透这一区域归因于一系列血管现象，例如存在迁移调节剂，例如TME3细胞内皮，它能够控制TME合成的细胞因子，此外还充当防止渗透的选择性屏障。

在正常情况下，内皮负责分泌ICAM1和VCAM1等物质，以促进炎症细胞的迁移和渗出；然而，致癌内皮抑制这些分子以逃避免疫反应。它还刺激释放逃逸促进剂，如ALCAM（活化的白细胞细胞粘附分子），替换趋化因子受体，并诱导T细胞的整合素依赖性停止。另一方面，血管元素，如HEV（高内皮静脉），由于其在某些恶性肿瘤（如黑色素瘤和乳腺癌）中对T细胞的招募的最优适应，与免疫细胞向固体肿瘤的有效迁移有关。

在淋巴细胞迁移过程中，选择素、整合素和趋化因子受体等粘附分子影响细胞运输。这些粘附分子与细胞因子的结合产生了淋巴细胞滚动现象，随后是一系列生化事件，最终导致内皮的穿透和穿过内皮的迁移到肿瘤区域。

同样，分泌趋化因子等物质对于免疫细胞迁移至关重要。这些在基质、癌症和免疫细胞中过度表达的分子，通过产生趋化梯度，在肿瘤生长和TME重塑中发挥着基本作用，最终调节细胞运输。

然而，在肿瘤和基质细胞中，细胞因子分泌减少，从而增加了逃避免疫反应的机会。此外，这些细胞因子的变化方式是T淋巴细胞上表达的受体无法识别它们。此外，胰腺、卵巢和乳腺癌中的转化细胞有能力分泌细胞因子，例如CXCL12，它抑制CAR T细胞的增殖和迁移，从而干扰细胞向肿瘤区域的输送。

除了固体肿瘤的抑制特性外，制造缺陷可能会影响CAR T细胞的归巢。新分离的CAR T细胞通常具有针对不同趋化因子的多种受体，这些受体可以通过体外长期扩增而改变。另一方面，在CAR编程过程中丢失某些组分，例如在肿瘤基质中降解硫酸肝素的酶硫酸肝素酶，可能会增加淋巴细胞穿透实质时的无效性。

最后，值得强调的是，在CAR T细胞疗法的限制中，尽管对这种治疗方法非常感兴趣，但其应用非常有限。大多数临床试验在美国（n=377）、中国（n=636）和欧洲（n=58）进行。2021年，只有大约2500名患者接受了CAR T细胞；根据EBMT注册，与有指征接受CAR T细胞输注的肿瘤学患者比例相比，这些数字似乎特别低，得出的结论是大约99%的潜在候选人没有接受治疗。解决这个特定问题的答案在于治疗的高成本，估计为500,000美元，以及通常需要21-35天的复杂和漫长的制造过程。如果目标是将CAR T细胞确立为癌症的未来标准治疗，就必须为公众开发更实惠和实用的方法（见图4）。

1.抗原：在液体恶性肿瘤（如白血病和淋巴瘤）中，目标抗原是高效的，而固体肿瘤由于其抗原表达的稀缺和异质性，构成了挑战；已经测试了各种抗原，如CAIX、EGFR、Her2/neu和PSMA等；然而，结果并不完全令人满意，特别是与用于治疗B细胞恶性肿瘤的CD19抗原相比，固体肿瘤中向下指的箭头代表了这些恶性肿瘤中抗原的稀缺性，与之相反，液体肿瘤中向上指的箭头反映了这些癌症中这些表面分子的可用性。

2.免疫抑制性TME：固体肿瘤中敌对的肿瘤微环境（TME）阻碍了成功的CAR T细胞疗法的发展，因为这种环境不仅促进肿瘤的发展，而且还能够使免疫细胞失活，因此阻碍了CAR T细胞的工作；与之相反，液体肿瘤没有这些问题，因为这些细胞是“流动的”，在血液或淋巴管中循环。

3.淋巴细胞归巢：对于T细胞来说，在白血病和淋巴瘤中找到目标抗原并不是一个特别困难的任务，因为这些细胞可以在血液中循环；然而，在固体肿瘤中，CAR T细胞必须被运送到特定部位，穿透肿瘤基质，并避开多种抑制分子才能到达目标。

5.增强CAR T细胞在实体肿瘤中效力的优化 

5.1. 特异性和毒性 

迄今为止，由于在固体肿瘤中使用的靶标缺乏特异性以及肿瘤异质性可能导致的疾病复发引起的毒性可以通过各种正在开发的方法避免。解决靶向肿瘤外毒性的最理想解决方案可能是找到仅在癌细胞中表达的抗原。例如，胎儿抗原如胎儿乙酰胆碱受体已被提议用于治疗横纹肌肉瘤。同样，糖基化MUC 1已被提议用于腺癌。此外，在细胞输注前筛选适当的抗原可能是对抗肿瘤异质性的优秀工具。

目前，正在CAR T细胞上实施几种旨在增加特异性和减少肿瘤逃逸的技术。提出了不同的模型，包括具有多个靶标的嵌合受体，其中双CAR、TanCAR和iCAR是主要的生物特异性CAR。双CAR表达两个受体，每个受体针对特定的抗原。在这种情况下，需要同时表达两种抗原才能正确激活T细胞，从而增加治疗特异性。另一方面，TanCAR或串联CAR具有一个受体，能够由于相邻的抗原识别域而识别不同的抗原。这种模型允许在两种抗原都结合时协同激活细胞外域。尽管这种模型比双CAR特异性较低，但在丢失一种抗原后仍然可以持续存在，从而防止肿瘤逃逸。最后，iCAR或抑制性CAR与常规CAR共同施用，但识别不同的抗原。当目标细胞表达两种确定的肿瘤抗原时，与PD1或CTLA-4细胞质域结合的iCAR被激活，并传递减少CAR T细胞功能的负信号，目标是减少在正常组织中表达但在肿瘤中减少的蛋白质的消除。

同样，已经设计了具有SynNotch技术的调节受体。这些受体由一个细胞外抗原识别域和一个细胞内“Notch Cleavage”域组成，与转录因子融合。一旦T细胞与第一个抗原结合，SynNotch系统诱导表达一个在存在第二种抗原时调节细胞活性的次级CAR。

另一种增加治疗特异性的方法集中在自然杀伤细胞（NK细胞）上，它们表达能够区分正常细胞和转化细胞的受体。在这方面，NKG2-D识别域及其配体，多种在肿瘤中过度表达的热休克蛋白，已在多种类型的肿瘤中使用；一旦创建了联合，这将产生T细胞的激活，随之而来的是抗肿瘤活性的增加。另一方面，诸如基于抗体的CAR开关之类的替代品扩展了在一个构建中具有多个靶标的可能性，通过在特定的抗TAA抗体中加入一个“标签”。随后，这些被重定向以消除表达该抗原的细胞。然而，已经表明这种程序的有效性反过来取决于诸如给药的细胞剂量和CAR T细胞穿透肿瘤位点的能力等因素。

最后，有一些修改旨在控制T细胞过度激活。近年来，“自杀基因”的实施引起了广泛关注。这种策略允许选择性地消除遗传工程改造以编码将非毒性分子转化为毒性分子的基因的CAR T细胞，这些基因可用于诱导凋亡。同样，也设计了药物诱导的消除系统。其中一种方法是利妥昔单抗诱导的消除系统，其中植入的T细胞在给药利妥昔单抗后变成抗体配体。

5.2. 肿瘤微环境

如前所述，肿瘤微环境代表了CAR T细胞疗法的一个障碍。在渗透后，T细胞遭受功能转换，抑制它们的抗肿瘤活性，从而阻碍肿瘤抑制。已经提出添加如CD28或4-1BB等共刺激分子来绕过这个问题。这些分子延长了T细胞的激活，延长了其持久性。此外，还提出了“开关受体”的概念。这些受体能够将抑制信号转化为刺激物。此外，还构想了具有共刺激域的CAR构建，能够在抗原识别后激活特定途径，导致IL-Rrb释放。

其他称为远程控制CAR的模型仅在存在设计为在治疗给药后可以修改的特定靶标的适配分子时才激活，这一特性对于通用CAR特别有用。此外，这种模式可能比定制的这些受体的发展更快。同样，最近的临床试验在添加转录因子JUN后的GD2 CARs的效力方面取得了有希望的结果，提高了T细胞的抗性和抗肿瘤效力，无论是液体还是固体肿瘤。此外，研究还深入探讨了通过抗原呈递细胞（APCs）在淋巴组织中可能的外部激活CAR T细胞以及这些肠毒素的组合，以增加扩张和抗肿瘤反应。

最流行的治疗策略之一是对抗免疫抑制，涉及第四代CAR或TRUCKs，它们专门设计用于产生和分泌促炎细胞因子和其他转基因产品，如IL-15、IL-18和IL-21；然而，IL-12是最突出的免疫调节剂。这种细胞因子促进抑制细胞的转化，并增加T细胞介导的细胞毒性。此外，表达IL-12的细胞能够极化Th1淋巴细胞，以吸引其他免疫细胞并促进消除对CAR T细胞“不可见”的肿瘤细胞。同样，这种方法也可用于选择性输送和释放具有局部效应或其他毒性过高而无法系统给药的其他元素。几项临床试验已经证实了TRUCKs的成功及其对持久性、存活和细胞毒性活性的积极影响。

肿瘤对免疫反应最显著的效应之一是对免疫检查点的调节。在这方面，肿瘤微环境在改变这