外泌体可能是下一代有前景的无细胞疫苗
摘要：传统疫苗在对抗某些持续性感染和病原体方面存在局限性。开发新型疫苗技术对未来尤为重要。外泌体在生理和病理过程中扮演着重要角色。外泌体具有许多优势，例如固有的生物相容性、无毒性，这使得它们成为疫苗中更理想的候选者。然而，外泌体的研究还处于起步阶段，产量低、纯度低和靶向性弱等障碍限制了它们在疫苗中的应用。因此，需要进一步探索以改进这些问题，进而促进外泌体的功能研究。在这项研究中，我们回顾了外泌体的起源、分类、功能、修饰、分离和纯化以及表征方法。同时，我们专注于外泌体在癌症和COVID-19疫苗中的作用和机制。
1.引言
在过去的一个世纪中，疫苗接种一直是最伟大的公共卫生成就之一。疫苗是减少由传染病引起的发病率和死亡率的关键工具。据报告，疫苗每年在全球至少挽救了2至300万人的生命。天花已被根除，脊髓灰质炎几乎在全球范围内消失，这归功于疫苗的使用。传统疫苗技术已广泛用于细菌和病毒病原体，但它们未能治愈一些持续性感染和具有高序列变异性、复杂病毒抗原和新出现病原体的病原体。开发新型疫苗技术至关重要。外泌体不仅可以在一系列传染病中有效传递疫苗成分，还可以在细胞之间转移基因、脂质、蛋白质和RNA，以及抗原呈递。它们还调节生理和病理过程。与此同时，它们固有的生物相容性，无毒性，以及具有穿越生物屏障（如血脑屏障）的能力，并通过其表面配体和受体穿透多个组织。这些研究的发现表明，通过不同方法修饰的外泌体将具有作为生物标志物、疫苗和药物载体的潜力。外泌体在生物安全性方面优于其他纳米颗粒，目前越来越多的证据表明，外泌体将作为未来无细胞癌症疫苗的基础。
2.外泌体的组成和生物发生
外泌体是大约30-150纳米的细胞外囊泡，几乎由所有哺乳动物细胞分泌。16 外泌体起源于初期的内吞体。细胞膜的第一次内陷形成早期的分选内吞体，这些在内吞体分选复合体和相关运输蛋白的作用下形成晚期分选内吞体。晚期分选内吞体的第二次内陷导致形成多囊泡体。随后，一旦多囊泡体与质膜融合，外泌体就被释放到细胞外环境中。外泌体被释放到细胞外环境后，通过受体-配体相互作用或脂质粘附到细胞上，被各种细胞摄取，然后通过内吞作用、吞噬作用、胞饮作用或与细胞表面膜融合，完全内化，从而外泌体将货物释放到目标细胞中并发挥生物学功能。外泌体携带的货物包含丰富的酶、转录因子、热休克蛋白、主要组织相容性复合体、细胞骨架成分、信号转导蛋白、四跨膜蛋白、脂质、RNA和DNA。据报告，外泌体参与了细胞内不必要的蛋白质或分子的清除、细胞间的物质交换、细胞间通讯、病原体传播、免疫系统的调节和抗原呈递。
外泌体分为天然外泌体和人工外泌体，这取决于它们是否被人为修饰。天然外泌体细分为动物源性和植物源性。几乎所有类型的动物细胞分泌外泌体，包括肿瘤细胞、肥大细胞、树突状细胞、间充质干细胞、B细胞、T细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、神经元、脂肪细胞、内皮细胞和上皮细胞。植物源性外泌体作为一种新的治疗选择出现并且目前很有前景，如姜源外泌体样纳米颗粒（GELN-RNA），通过IL-22依赖机制改善小鼠的结肠炎，以及GELN microRNA消除了由exosomesNsp12Nsp13介导的肺部炎症。此外，细菌源性外泌体参与了疾病过程。例如，由结核分枝杆菌衍生的外泌体可能通过向受体细胞传递结核分枝杆菌组分，在结核病的发病机制中发挥重要作用。
3.外泌体工程
外泌体的适当特性使它们非常适合作为药物传递载体，但它们的临床应用面临几个挑战，如有限的半衰期和低溶解度。天然外泌体缺乏特定的细胞或组织靶向特性。为了优化外泌体的靶向并克服使用自体的局限性，因此许多研究表明，通过表达特定抗原分子增强了工程化外泌体的抗癌免疫原性。工程化外泌体呈现多种抗原，并且可以通过两种方式设计，亲本细胞基础修饰和分离后修饰。与基于亲本细胞的外泌体相比，分离后的外泌体在技术上不那么复杂。典型的操作包括电穿孔、挤出、超声、孵化和冻融可以直接应用于分离后的外泌体工程。
基于亲本细胞的外泌体修饰发生在外泌体从亲本细胞中分离出来之前。最常见的修饰方法是利用外泌体信号肽将蛋白质转移到外泌体表面。另一种方法是通过募集分子分选模块（MSMs）将分子装载到外泌体腔中，这些模块与感兴趣的蛋白质或RNA结合，并将它们驱动到外泌体进行分类蛋白质和RNA进入腔室。此外，RNA装载方法也用于基于亲本细胞的外泌体工程。有一个名为EXOtic（Exosomal Transfer Into Cells）的设备用于装载mRNA。在EXOtic设备中，除了RNA包装系统外，还有一个细胞质传递辅助系统和一个靶向模块。这些系统协同工作，使治疗性mRNA能够装载到外泌体中。
亲本细胞可以通过载体转染产生表面修饰的外泌体，这些外泌体可以通过自然生物合成过程表达靶向基团。间接外泌体修饰在表达和稳定性方面比直接外泌体修饰具有一些优势，这些优势体现在工程化外泌体的靶向基团上。接下来，我们讨论了一些关于针对癌症的基因工程外泌体的细节。例如，可以使用乳凝素的C1C2结构域在治疗性外泌体表面表达抗Her2单链可变片段（scFv）。亲本细胞通过基因工程产生靶向Her2的外泌体，通过表达抗Her2 scFv与乳凝素C1C2结构域C末端融合的融合蛋白，并使用N末端的信号肽将融合蛋白引入分泌途径，从而诱导其与外泌体外膜结合。与非工程化外泌体相比，工程化外泌体在表达HER2基因的乳腺癌细胞中的吸收更好，显示出体内积累增加了两倍和两到三倍。
直接外泌体基因修饰可以分为基于膜蛋白的基因修饰和基于脂质-蛋白质相互作用的基因修饰。许多外泌体膜蛋白，如Lamp2b和四跨膜蛋白，可以用于展示靶向基团。例如，一项研究表明，通过在CD9的氨基酸170-171之间插入ApoB修饰的外泌体通过劫持受体介导的转胞吞作用促进了BBB穿透，并且工程化外泌体在静脉注射后延长了在大脑中的滞留时间。
直接外泌体工程的另一种方法是化学修饰，它通过结合和疏水插入将各种类型的配体装载到外泌体膜上。外泌体膜由脂质和蛋白质组成，可以通过脂质插入、化学连接、亲和结合和酶促连接进行化学修饰。外泌体膜允许脂质和标记脂质的分子的疏水插入，并且用脂质片段标记的靶向肽和寡核苷酸可以通过简单的混合和孵化插入到外泌体膜中。DSPE-PEG是广泛使用的模块，用于在外泌体表面锚定靶向分子。一项研究表明，使用DSPE-PEG修饰的外泌体克服了BBB并实现了针对治疗胶质母细胞瘤的药物的靶向递送。化学连接是基于外泌体膜上的脂质或蛋白质的反应基团，可以与标记反应片段的肽反应，从而允许靶向肽修饰外泌体。亲和结合是一种方法，通过该方法，靶向基团附着在蛋白质或外泌体膜脂质上的亲和分子上。酶促连接是一种基于蛋白质连接酶的方法，通过外泌体膜蛋白和目标蛋白/肽之间的酶促反应实现外泌体表面修饰。
此外，结构改变是提高外泌体有效性的另一种策略。外泌体-脂质体杂交用于优化外泌体的表面特性，杂交策略可以改变免疫原性，提高胶体稳定性，增加在血液中的循环时间，并提高目标细胞的摄取量。通过聚乙二醇（PEG）进行的杂交可以避免免疫细胞的攻击，通过形成水化层，因此，工程化外泌体实现了更高的稳定性和更长的循环时间。此外，用磁性化合物修饰的外泌体可以有效地应用于外泌体检测、分离和靶向药物递送。例如，通过结合磁性纳米粒子的磁靶向特性和药物递送能力以及工程化外泌体的BBB穿透能力和siRNA封装特性，建立了一种新的治疗平台，用于治疗胶质母细胞瘤。
尽管细胞资源对体内外泌体的生物分布至关重要，但大部分注射的外泌体分布在网状内皮系统，包括肺、肝脏、脾脏和胃肠道，外泌体被它们清除，导致循环半衰期短。此外，巨噬细胞捕获在外泌体清除中也起着重要作用。外泌体的靶向不仅增加了外泌体递送的有效性，还减少了脱靶副作用。外泌体的进一步临床应用应集中于它们的操控，以增加它们在循环中的寿命，同时减少免疫清除。一项研究表明，通过在外泌体表面整合不同的抗吞噬分子（包括CD47、CD24、CD44等），使外泌体对免疫系统“不可见”，从而在外泌体表面实现更好的系统生物利用度，因为它们在循环中的停留时间更长。例如，含有CD47的外泌体通过与α-配体信号调节蛋白相互作用，实现对吞噬作用的保护。
4.外泌体的分离和表征
4.1.外泌体分离
外泌体分离技术在过去几十年中取得了巨大发展。目前，外泌体分离和纯化的方法通常包括超速离心、超滤、尺寸排除色谱（SEC）、聚合物沉淀、免疫亲和捕获技术以及微流控技术，这些方法可以结合使用以获得更好的结果。表1显示了外泌体分离方法的比较优势和劣势。
超速离心是使用最广泛的外泌体分离技术，适用于大多数样本，并且由于其成熟的技术和低成本，被认为是外泌体分离的“黄金标准”。差速超速离心（DUC）和密度梯度超速离心（DGUC）是两种替代的分离技术。差速超速离心成本低。缺点是耗时太长，设备成本高，回收和纯度低，并且重现性差。此外，重复离心也可能对外泌体造成一些损害。通过密度梯度超速离心获得的细胞外产物的纯度高于差速超速离心，但由于所需的初步准备、产量低、操作繁琐和长时间的离心（>16小时），其临床应用受到限制。超滤是一种基于分子大小的分离方法。它通过将大量材料中的外泌体浓缩到小体积中进行进一步纯化，该方法简单快速，获得的外泌体产量适中。然而，通过超滤分离的外泌体可能会因压力而变形或破裂。此外，它容易堵塞孔洞。如果仅使用这种方法，外泌体会被非外泌体游离血浆肽如白蛋白和α-1-抗胰蛋白酶污染。尺寸排除色谱是一种基于分子大小变化的分离方法。这种方法产生的外泌体产量和纯度高，并且由于它利用重力流动，因此保持了外泌体的完整性和生物活性。然而，外泌体无法与相同大小的囊泡区分开来。聚合物沉淀产生纯度低、产量高的外泌体。通过这种技术提取的外泌体容易受到脂蛋白或病毒粒子的污染，影响未来的分析（如蛋白质组学和质谱）。最近，许多依赖沉淀技术的商业试剂盒已用于外泌体分离，ExoQuick试剂盒被广泛使用。利用磁珠的免疫亲和技术提供了更高的捕获效率和更大的灵敏度。免疫亲和方法不受外泌体形态的影响，具有高特异性和纯度，产量适中的特点。然而，通过这种方法分离的外泌体只是具有阳性标记的亚型，不包括所有类型的外泌体。由于需要抗原-抗体结合的时间，这种方法耗时。此外，在抗体结合后还需要额外的步骤来分离和纯化外泌体。微流控被认为是一种有前景的方法，它将样品处理、分析、监测和其他过程集成在芯片上，实现了小型化、高通量的能力，减少了时间消耗。它能够区分、捕获、富集和分离形状和大小非常相似的颗粒。这种分离技术具有进料体积小、高通量、样品处理快速以及高纯度和灵敏度的优点。然而，该程序成本高，复杂且不适合大规模生产。
4.2.外泌体的表征
EVs（细胞外囊泡）在大小和形态上相似，在外泌体分离后，使用一些表征方法区分不同的EVs亚型是必不可少的。特别是，某些特定的标记物被用来确定提取的材料是否为外泌体，以验证外泌体的分离方法。基于这些特性，表征外泌体的方法可以简要地分为定量外泌体分析方法、定性外泌体表征方法和单囊泡表征方法。
外泌体总数、蛋白质计数、脂质计数和DNA/RNA计数用于外泌体的定量表征。外泌体总数经常通过纳米粒子追踪分析（NTA）、流式细胞测量（FCM）、动态光散射（DLS）和可调电阻脉冲传感（TRPS）来检测。脂质计数已通过使用技术如荧光显微镜和傅里叶变换红外光谱（FTIR）来实现。质谱、西方印迹（WB）和酶联免疫吸附分析（ELISA）用于蛋白质计数。对于RNA计数，聚合酶链反应（PCR）、微阵列分析和下一代测序（NGS）被利用。蛋白质标记物、脂质标记物和DNA/RNA标记物用于外泌体的定性表征。蛋白质标记物通常使用质谱、流式细胞测量（FCM）和酶联免疫吸附分析（ELISA）来识别。对于DNA/RNA标记物的识别，采用PCR、微阵列分析和下一代测序（NGS）。此外，质谱用于检测脂质标记物。在评估单个囊泡时，结构、大小和化学成分是需要考虑的显著方面。外泌体的结构已通过应用扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）、冷冻电镜（cryo-EM）和原子力显微镜（AFM）来可视化。外泌体的大小已通过纳米粒子追踪分析（NTA）、流式细胞测量（FCM）、动态光散射（DLS）和可调电阻脉冲传感（TRPS）来测量。拉曼光谱用于确定化学成分。还有许多单独或组合的方法用于执行外泌体分析，如表面等离子共振生物传感器、基于微芯片的技术、电化学技术、荧光和比色法。图1显示了常见的外泌体表征方法。
5.外泌体和疫苗
外泌体因其能够刺激树突状细胞识别和杀死癌细胞而引起了极大的兴趣。此外，外泌体将抗原转移到DC（树突状细胞）以采取行动，引发并放大特定的免疫反应。这些特性使其成为癌症疫苗的理想候选者。为了提高外泌体的靶向性，许多研究已经基因工程化外泌体以表达特定的抗原分子或靶向癌细胞。为了实现外泌体的基因修饰，设计并开发了一个名为合成多价抗体重定向外泌体（SMART-Exo）的新型外泌体平台。表2描述了现有疫苗和基于外泌体的疫苗的优点和缺点。
目前，将蛋白质装载到外泌体上有两种方式。一种方式是将抗原喂养给树突状细胞（DCs），然后收集上清液以分离外泌体进行间接装载肽段，这确保了抗原肽与MHC分子的结合。MHC分子对DCs和T细胞之间的相互作用至关重要。然而，这种策略的限制是必须由DCs识别的抗原类型。另一种方式是任何可溶性抗原都可以附着到外泌体上，并可用于修改外泌体以增加额外的功能，例如向外泌体添加粘附分子，可以靶向特定部位。
5.1.外泌体和癌症疫苗
外泌体不仅可以刺激抗肿瘤免疫反应，还可以通过细胞间信号传递和抗原呈递的能力抑制抗肿瘤免疫反应，以促进肿瘤生长。一个吸引人的研究课题是正常来源和肿瘤来源外泌体如何影响肿瘤微环境，这为增强抗肿瘤免疫反应、发展外泌体疫苗和使用外泌体作为药物纳米载体提供了机会。
在癌症免疫疗法中，富含肿瘤抗原的肿瘤来源外泌体（TEX）可以由APC（抗原呈递细胞）呈递以诱导T细胞和B细胞反应。肿瘤来源外泌体（TEX）已成为癌症免疫疗法中有前景的无细胞治疗疫苗。TEX富含主要组织相容性复合体I和II（MHCI和MHCII）、CD81、CD54和CD63等蛋白质，这些蛋白质可以用于外泌体与DCs上的相关蛋白结合和摄取。同时，热休克蛋白在TEX上呈递，包括71千道尔顿热休克蛋白、千道尔顿热休克蛋白4和HSP90 α & β。热休克蛋白（HSP）靶向并激活包括树突状细胞（DCs）在内的抗原呈递细胞，从而在先天和适应性免疫反应之间提供自然的联系。HSP具有强大的佐剂能力，增强了TEX的免疫原性并提高了癌症疫苗的有效性。
有效的癌症疫苗的设计协议必须能够触发由T细胞介导的强烈和持久的免疫反应。TEX包含肿瘤相关抗原并直接或间接参与抗原呈递，触发CD8+ T细胞反应，用于交叉启动免疫疗法。然而，TEX诱导的免疫抑制和有限的TEX免疫原性，以及单独应用TEX在体内的频繁应用导致不满意的抗肿瘤免疫效果。因此，已经使用几种策略来提高TEX疫苗的有效性。TEX可以通过基因或非基因修饰来丰富肿瘤抗原、microRNAs和免疫刺激分子，以直接增强肿瘤细胞死亡或被免疫细胞杀死。另一种策略是通过DC装载来改善TEX疫苗接种，TEX装载的DCs促进了未成熟CD8+ T细胞向成熟的抗原特异性CTL细胞的转化，诱导巨噬细胞中NF-κB的激活，并通过释放肿瘤坏死因子（TNF）参与肿瘤细胞毒性。
除了肿瘤来源的外泌体，树突状细胞来源的外泌体（DCexos）也具有成为无细胞治疗疫苗的潜力，因为它们具有抗肿瘤免疫抑制、显著的生物可用性和生物稳定性。DCexos是惰性囊泡，在体内具有更长的半衰期，并且可以储存更长的时间。据报道，DCexos还比DCs更抵抗肿瘤或肿瘤微环境（TME）的免疫调节，因此支持它们作为肿瘤疫苗的临床应用。
树突状细胞来源的外泌体（DCexos）富含MHC I类和II类复合体、热休克蛋白（HSPs）以及CD86等共刺激分子，这些分子能够刺激CD4+辅助T细胞和CD8+ CTLs的激活，并诱导强大的抗肿瘤效应。一些功能分子，如MHC-I、MHC-II、CD40、CD80、CD86，以及DCexos表面的FasL、TRAIL和NKG2D（自然杀伤细胞组2D）配体，有助于增强先天和适应性抗肿瘤免疫反应。在抗肿瘤反应中，DCexos还能诱导其他免疫细胞如NK细胞。在使用修饰的DCexos治疗癌症的临床试验中，NK细胞的效应功能得到增强，这表明DCexos可能在体内诱导NK细胞功能。
据报道，DCexos显著增加了CD8+ T淋巴细胞的数量，导致干扰素-γ和IL-2水平升高，降低肿瘤部位的CD25+ Foxp3+ Treg细胞，以及降低IL-10和TGF-β，从而改善肿瘤微环境。而在肿瘤微环境中，DCexos含有TNF、Fas配体（FasL）和与TNF相关的凋亡配体（TRAIL），可在肿瘤细胞中引起凋亡。同时，DCexos通过TNF超家族配体激活自然杀伤细胞，从而对肿瘤产生抑制作用。
尽管我们专注于将DCexos作为肿瘤疫苗，但来自其他细胞如巨噬细胞、NK细胞、B细胞、T细胞、间充质干细胞和肿瘤细胞的外泌体也已在肿瘤疫苗研究中得到应用。通常，来自免疫细胞的外泌体促进T细胞的增殖。外泌体通常由成熟的DCs呈现以引发T细胞反应，因为外泌体上的抗原必须被DCs摄取才能激活T淋巴细胞，这在一定程度上避免了使用佐剂，而且外泌体可以直接激活T淋巴细胞。
在抗原呈递过程中，B细胞衍生的外泌体首先与抗原相互作用，然后调节T细胞的激活和细胞因子分泌。此外，据报道，细胞毒性T淋巴细胞（CTL）衍生的外泌体含有CTL表面膜分子（CD3、CD8和TCR），通过TCR-MHC/抗原相互作用导致肿瘤细胞死亡。NK细胞衍生的外泌体发挥重要的治疗功能，通过呈现穿孔素和FasL对黑色素瘤产生细胞毒性效应，并参与体内外的凋亡。M1型极化的巨噬细胞分泌的外泌体可以增强抗肿瘤疫苗的活性，并促进CTL相关的免疫反应。M1型极化的巨噬细胞分泌的外泌体可以被淋巴结（LNs）中的局部巨噬细胞和DCs摄取，增加Th1细胞因子的释放，并增强CTL反应。在黑色素瘤中，巨噬细胞衍生的外泌体增强了肿瘤多肽疫苗的效力，并显著抑制了肿瘤生长。图2显示了肿瘤来源的外泌体和免疫细胞来源的外泌体对肿瘤细胞的作用机制。
5.2.外泌体和COVID-19疫苗
目前，COVID-19大流行的爆发加速了EVs的研究，特别是基于EVs的疫苗的开发。由于外泌体是具有免疫原性、高生物相容性和固有的货物装载能力的必不可少的细胞间通讯分子，它们为COVID-19疫苗的开发提供了新的机会，并可能在限制COVID-19大流行中发挥关键作用。细胞外囊泡（EVs）在生物学上具有几个优于病毒载体的优势，如内源性起源、能够穿越生物屏障、高稳定性、免疫原性和低毒性。一些公司正在试验和测试基于EVs平台的COVID-19疫苗。例如，一家生物公司研究了两种不同的COVID-19疫苗。一种疫苗由转染表达SARS-CoV-2的四种结构蛋白（S、E、M和N蛋白）的质粒的人类HEK293细胞组成。另一种是一种mRNA疫苗。EVs装载了五种mRNA，编码修改后的SARS-CoV-2刺突蛋白、核衣壳蛋白、膜蛋白、细胞质蛋白和武汉-1分离株的全长刺突蛋白。另一家公司开发了一种疫苗，其中诱导的多能干细胞系转染了编码SARS-CoV-2抗原蛋白的不同mRNA。这些细胞产生大量携带病毒mRNAs和相应抗原蛋白的EVs。这种疫苗拥有多种mRNA，比单一mRNA疫苗更好。另一种exoVACCTM疫苗是一种模块化疫苗系统，利用EVs的优势，可以同时传递特定抗原和免疫刺激佐剂到抗原呈递细胞（APCs）以引发细胞和体液免疫反应。最近的报告显示，装载编码SARS-CoV-2刺突和核衣壳蛋白的mRNAs的外泌体疫苗引发了持久的细胞和体液免疫反应，并比现有的COVID-19疫苗产生更少的不良反应。根据Kuate等人的说法，小鼠最初用含有SARS-S蛋白的外泌体疫苗免疫，然后用表达S蛋白的腺病毒载体疫苗免疫，它们的中和抗体滴度高于SARS患者的血清中的抗体滴度。此外，两种疫苗都在小鼠中诱导了中和抗体滴度。因此，基于EV的疫苗设计协议可以应用于SARS-CoV-2的治疗。
6.结论
尽管基于细胞外囊泡（EV）的疫苗具有许多优点，但在临床应用中仍存在许多需要克服的障碍。例如，大规模生产和分离外泌体仍然是一个巨大的挑战。在靶向治疗方面，可以通过多种方法修改外泌体的原始结构，如基因工程、化学程序、物理技术和微流控技术，这使得外泌体能够装载额外的货物，扩大了外泌体在生物医学应用中的潜力。总之，发展外泌体修饰技术、自动化制造流程和严格的质量控制系统对于大规模生产高纯度的工程化外泌体至关重要。需要大量的细胞来分泌足够的外泌体以供大规模生产。生物反应器能在很短的时间内产生大量的细胞，目前最流行的生物反应器是空心纤维生物反应器和搅拌槽生物反应器。可以通过不同的方法实现外泌体的分离。尽管传统的离心技术成本低廉，但耗时长。此外，这种方法提取的外泌体纯度低。超滤不需要昂贵的设备，可以用于大规模生产。然而，需要优化从杂质蛋白中分离外泌体的过程。尺寸排除色谱技术可以保持外泌体的完整性，但无法区分密度和大小相同的囊泡。聚合物沉淀法操作简单，易于放大。然而，聚合物沉淀法容易受到污染。免疫亲和分离技术特异性高，但需要在抗体结合后进行额外的分离和纯化步骤，不适合大规模生产。相比之下，利用精确的纳米级液体和颗粒控制能力的微流控技术，比目前的外泌体分离技术更快、更有效。然而，它不适合大规模生产。外泌体分离方法应确保完整性、灵敏度和特异性。应优化外泌体分离或组合方法，以获得高纯度的外泌体。
基于外泌体的疫苗在癌症和病毒性传染病方面展示了令人印象深刻的成果。灭活疫苗没有活性成分，技术成熟，但单剂量不足以诱导持久的免疫。腺病毒载体疫苗能诱导多个表位，并且可以大规模生产，但预先存在的抗腺病毒免疫反应可能存在不良事件。DNA疫苗允许构建编码不同抗原的单一疫苗载体，可以大规模生产，生产和储存稳定性高。然而，DNA疫苗只能引发较弱的免疫反应，需要传递剂才能到达细胞核。RNA疫苗可以快速将新型mRNA序列组装到现有疫苗配方中，没有与宿主细胞基因整合的风险。然而，RNA疫苗容易引发罕见和严重的过敏反应。重组蛋白疫苗需要佐剂，易于大规模生产，但只能表达蛋白质片段。相反，外泌体是有效的病毒抗原载体，它们以天然状态呈现抗原，并能够穿越血脑屏障，产生保护性免疫反应。与其他载体相比，如基于脂质的纳米颗粒和病毒载体，外泌体具有更低的免疫原性和更高的吸收率，并且在外泌体疫苗中安全高效地使用。